蛋白质是多肽化合物，含有两个或两个以上肽键。
双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。它是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1克每毫升氢氧化钠或氢氧化钾、0.01克每毫升硫酸铜配制。
具有两个或者两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。
蛋白质的肽键在碱性溶液中与双缩脲试剂中的二价铜离子反应，生成紫红色络合物。
因此，呈蓝色的双缩脲试剂可以通过颜色是否变成紫红色来鉴别蛋白质。
有关双缩脲反应,简述反应原理如下：
双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酰基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性溶液作用，生成紫色或者蓝紫色的络合物。
鉴定
由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
双缩脲法的原理
双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应.因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
注意事项
双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5：1。但是双缩脲试剂不用现配现用，可以在蛋白质溶液中先加入NaOH营造碱性环境，再加入CuSO4。这是与斐林试剂不同的地方。
双缩脲反应是指：
具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与铜的一价离子反应，生成红紫色的络合物的化学反应。
所有的蛋白质均有此显色反应，双缩脲试剂就是指能与具有两个以上肽键的化合物发生红紫色显色反应的试剂，它是氢氧化钠和硫酸铜两种溶液组成的。
在双缩脲反应的实验过程中，先在含蛋白质的溶液中加入等体积的氢氧化钠溶液，混合均匀后，再滴几滴硫酸铜溶液，即先后加入含蛋白质的溶液，混合液中就没有铜的二价离子，显色反应就不会发生。
双缩脲法测蛋白质本实验为什么要在显色的30分钟后测定
一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O
或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N
NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4 5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6 4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%
NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
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