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PCR产物的检测方法有哪些?_琼脂糖凝胶电泳原理

栏目:数码科技

作者:B姐

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时间:2024-02-21 09:54:57

PCR产物的检测方法:

琼脂糖凝胶电泳

这是实验室最常用的方法,简便易行,只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时,由于泳动速度不同而被分离,经溴化乙锭(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。

用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%,应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖,这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

(1)制胶

琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来,过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml,称取琼脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波炉加热2-5min,使琼脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室温等温度下降至60℃时,加入终浓度0.5μg/ml的EB液,充分混匀后倒板(注意排除气体)。

(2)加样和电泳

上样时一般取PCR反应液5~10μl,加入3μl溴酚兰液,充分混匀,加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪,电泳工作液为0.5×TBE液,接通电源,使样品由负极向正极移动。

60-100V恒压电泳约30-60分钟。

(3)检测

将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测,DNA产物与荧光染料EB形成橙**荧光复合物。观察各泳道是否有橙**荧光带出现,并与扩增时所设的阳性对照比较,判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照,判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐,但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围:

(1)制胶

在两块制胶玻璃板中间放上垫片,放上制胶架,拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。

制备适量合适浓度的凝胶,使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

不同浓度(%)聚丙酰胺凝胶的制法:

在加入TEMED和10%过硫酸铵后,立即混匀,倒入放置45℃角的玻璃板内,完全注满(注意不要有气泡),迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧,待30-60分钟胶聚合后,取下胶板,放入电泳槽中固定。

(2)加样和电泳

上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液,溢过加样孔,拔出梳子,排出加样孔中的气泡,将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀,用微量注射器加入加样孔底部,使样品在孔底成一层,两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。

以2-10V/cm电压电泳,电泳时间足够长,使片断足以分开,待指示剂走到适宜位置时关闭电源,将胶片取出。

(3)银染

分开两块玻璃板,将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min,双蒸水洗3次,每次2min,然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min,吸去AgNO3液,用双蒸水洗3次,每次30s,加入100ml显色液约7-10min,待DNA带显示清除时,吸去显色液,加入固定液Na2CO3,静置2-3min,取出凝胶观察。

琼脂糖凝胶电泳时胶中dna是靠什么发出荧光的

跑胶时,可用4微升RNA溶液和2微升loadingbuffer。

跑胶的时候,可以用4微升RNA溶液加2微升loadingbuffer。保证RNA的浓度在150到300纳克每微升,这时所得到的条带会比较清晰。跑胶的时间可以适当延长一些。

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理:RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用百分之一到一点四的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的百分之一琼脂糖凝胶即可。

琼脂糖凝胶电泳的目的

琼脂糖凝胶电泳时胶中dna是靠荧光染色剂溴化乙锭发出荧光的。

溴化乙锭为一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,可用Polaroid底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。

溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团,它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。

扩展资料

观察凝胶中DNA的最简便、最常用的方法就是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。溴化乙锭是一种具有扁平分子的核酸染料,在高离子强度下,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。

在DNA溴化乙锭复合物中,DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而结合的染料分子本身吸收302nm和399nm的光辐射,因此吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。

因此对核酸分子染色之后,将电泳标本放置在紫外光下观察,便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位,即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA,也可以被清晰地显现出来。在适当的染色条件下,荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。

在包含有几种DNA片段的电泳谱带中,每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。

百度百科-凝胶电泳

百度百科-溴化乙锭

电泳原理只能用于分离DNA么

凝胶电泳在固体支持介质(如琼脂糖凝胶)中按大小分离DNA片段。将样品 (DNA) 移液到样品孔中,然后施加电流,使带负电荷的 DNA 迁移(电泳)向阳极、正极 (+) 端。迁移率与大小成正比:较小的片段移动得更快,并在凝胶底部结束。

1.琼脂糖凝胶电泳可以估计用限制性内切酶消化后 DNA 片段的大小,例如在克隆 DNA 的限制性作图中。

2.对PCR 产物分析,例如分子遗传学诊断或基因指纹图谱。

3.琼脂糖凝胶电泳通常用于解析具有不同超螺旋拓扑结构的环状 DNA,以及解析因 DNA 合成而不同的片段。

4.除了为片段大小分析提供出色的介质外,琼脂糖凝胶还可以纯化 DNA 片段。

简述凝胶电泳的原理与方法

你指得应该是琼脂糖凝胶电泳

dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

dna分子在高于等电点的ph溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同大小的双链dna几乎具有等量的净电荷,而不同大小的dna所具有的净电荷就不一样,在同样电场条件下受力也不一样。

其次,dna分子在凝胶中也会受到阻力影响,阻力有dna的大小和结构决定。大小就是脱氧核糖核苷酸量(或说分子量大小),分子量dna的一般结构在相同环境下迁移速度关系如下:环状>双链>环状开环

凝胶电泳(Gel electrophoresis)是指DNA分子提取得到以后,需要通过电泳技术来检测其数量和质量。琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是基因操作的核心技术之一,它能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。 该技术操作简单而迅速,已经成为许多通用的分子生物学研究方法,如DNA重组、DNA核苷酸序列分析等。

当一种分子被放置在电场当中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极,这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质,如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等,从而降低了对流运动,故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数,因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异,以及所带的净电荷的多少,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子状态,从这种意义上讲,DNA和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子。因此,当核酸分子被放置在电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。

PCR产物的检测方法有哪些?_琼脂糖凝胶电泳原理